Estudo para
validação de método rápido microbiológico aplicado a teste de esterilidade:
Técnica de Bioluminescência de ATP
Técnica de Bioluminescência de ATP
DOI:
10.11606/D.9.2014.tde-26052015-135426
Autor: Aline Marinho Picanço
Documento: Dissertação de Mestrado
Data de Defesa: 2014-08-25
Palavras-chaves: Validação; Método Microbiológico Rápido; Teste de Esterilidade; Bioluminescência de ATP
Autor: Aline Marinho Picanço
Documento: Dissertação de Mestrado
Data de Defesa: 2014-08-25
Palavras-chaves: Validação; Método Microbiológico Rápido; Teste de Esterilidade; Bioluminescência de ATP
Resumo:
A partir da avaliação e desempenho dos métodos
convencionais e alternativos de esterilidade, este estudo investiga a equivalência
ou possível superioridade do método rápido por meio da Bioluminescência de ATP.
Para o estudo foram utilizados microrganismos certificados na forma de Bioballs®
SingleshotTM, sendo adicionados a estes microrganismos Kocuria rosea e
Micrococcus luteus.
Por meio do método indireto (esterilidade convencional) e a Bioluminescência de ATP, foram validadas por meio do estudo da sensibilidade, especificidade, robustez e o limite de detecção do método alternativo. Sendo realizados ensaios com microrganismos, utilizando de níveis de contaminação, veiculados a uma solução salina.
Para obtenção de controles negativos, os produtos foram filtrados conforme o teste convencional e para a obtenção do controle positivo qualitativo foi adicionado 1 ml de cada suspensão microbiana preparada à membrana filtrante.
Para determinar a especificidade, foram empregados membranas contaminadas individualmente com os microrganismos.
O método alternativo foi avaliado em sua capacidade de cumprir os critérios de especificidade, sendo que sua especificidade foi avaliada pela capacidade do método em detectar os microrganismos propostos; seu limite de detecção teve por base a avaliação dos resultados das diferentes concentrações microbianas e a robustez foi avaliada a partir do estudo do impacto de diferentes lotes de meio de cultura.
Para determinar a especificidade dos microrganismos, foram testados os produtos: solução fisiológica 0,9%; Ringer lactato; solução de dextrose 5%; e solução de metronidazol 0,5%. Nessa fase, foi utilizado de concentrações de cada um desses produtos nas amostras, seguida da incubação por 96 horas até a leitura pelo método alternativo. Seus resultados foram positivos com todos os microrganismos e produtos testados. Para sua análise estatística, procurou-se avaliar o comportamento da detecção em função dos fatores: nível de contaminação, microrganismo e método, mas como o tamanho da amostra que foi utilizada foi pequeno para a elaboração de estudos dos fatores, foi realizado o teste de hipótese para duas proporções: a hipótese nula, proporção detectada pelo método convencional e igual à proporção do método Celsis.
Neste trabalho, optou-se pelo uso de uma tecnologia que fosse exatamente igual aqueles meios de cultura preconizados sem modificações, apenas com o diferença na substituição da observação visual macroscópica ou na detecção de hifas por resposta fornecida em leitura de bioluminescência de ATP, em que se preserva o número e volume das unidades testadas. Essa particularidade conduz com facilidade a operação de desenvolvimento paralelo entre os testes convencionais e os teste rápidos.
Uma vantagem adicional desta tecnologia é que ela consegue possuir, a partir de uma única filtração de amostra, os resultados inerentes ao teste convencional e alternativo, minimizando, desta forma, o risco de falsos resultados.
Este trabalho envolve a validação do método alternativo no qual se inoculou, intencionalmente, microrganismos conhecidos ao se trabalhar com os diferentes métodos. Nesse estudo em questão, os meios de cultura utilizados não apresentaram interferência no ensaio. Quanto à escolha dos produtos a serem testados, optou-se pelos produtos parenterais de grande volume de maior uso hospitalar, justificando-se a escolha dos produtos por se tratarem de soluções parenterais de grande volume, para as quais o grande tempo de incubação inerente ao teste de esterilidade ocasionam dificuldades logísticas e espaciais, nas incubadoras. Constituem-se, assim, limitações severas para os produtores, ocasionando pressões intensas das associações representativas sobre os organismos regulatórios, além de potencial risco de desabastecimento a hospitais e clínicas e, consequentemente, aos pacientes.
Tendo em vista os resultados obtidos, pode-se concluir que a tecnologia de bioluminescência de ATP é uma opção considerável para a análise de produtos estéreis, podendo oferecer, resultados mais rápidos que o método convencional. Apesar de não ser uma tecnologia rápida e permanecer dependente de limitações inerentes aos métodos baseados em crescimento, a técnica de bioluminescência de ATP pode ser caracterizada como um grande avanço na microbiologia farmacêutica.
Por meio do método indireto (esterilidade convencional) e a Bioluminescência de ATP, foram validadas por meio do estudo da sensibilidade, especificidade, robustez e o limite de detecção do método alternativo. Sendo realizados ensaios com microrganismos, utilizando de níveis de contaminação, veiculados a uma solução salina.
Para obtenção de controles negativos, os produtos foram filtrados conforme o teste convencional e para a obtenção do controle positivo qualitativo foi adicionado 1 ml de cada suspensão microbiana preparada à membrana filtrante.
Para determinar a especificidade, foram empregados membranas contaminadas individualmente com os microrganismos.
O método alternativo foi avaliado em sua capacidade de cumprir os critérios de especificidade, sendo que sua especificidade foi avaliada pela capacidade do método em detectar os microrganismos propostos; seu limite de detecção teve por base a avaliação dos resultados das diferentes concentrações microbianas e a robustez foi avaliada a partir do estudo do impacto de diferentes lotes de meio de cultura.
Para determinar a especificidade dos microrganismos, foram testados os produtos: solução fisiológica 0,9%; Ringer lactato; solução de dextrose 5%; e solução de metronidazol 0,5%. Nessa fase, foi utilizado de concentrações de cada um desses produtos nas amostras, seguida da incubação por 96 horas até a leitura pelo método alternativo. Seus resultados foram positivos com todos os microrganismos e produtos testados. Para sua análise estatística, procurou-se avaliar o comportamento da detecção em função dos fatores: nível de contaminação, microrganismo e método, mas como o tamanho da amostra que foi utilizada foi pequeno para a elaboração de estudos dos fatores, foi realizado o teste de hipótese para duas proporções: a hipótese nula, proporção detectada pelo método convencional e igual à proporção do método Celsis.
Neste trabalho, optou-se pelo uso de uma tecnologia que fosse exatamente igual aqueles meios de cultura preconizados sem modificações, apenas com o diferença na substituição da observação visual macroscópica ou na detecção de hifas por resposta fornecida em leitura de bioluminescência de ATP, em que se preserva o número e volume das unidades testadas. Essa particularidade conduz com facilidade a operação de desenvolvimento paralelo entre os testes convencionais e os teste rápidos.
Uma vantagem adicional desta tecnologia é que ela consegue possuir, a partir de uma única filtração de amostra, os resultados inerentes ao teste convencional e alternativo, minimizando, desta forma, o risco de falsos resultados.
Este trabalho envolve a validação do método alternativo no qual se inoculou, intencionalmente, microrganismos conhecidos ao se trabalhar com os diferentes métodos. Nesse estudo em questão, os meios de cultura utilizados não apresentaram interferência no ensaio. Quanto à escolha dos produtos a serem testados, optou-se pelos produtos parenterais de grande volume de maior uso hospitalar, justificando-se a escolha dos produtos por se tratarem de soluções parenterais de grande volume, para as quais o grande tempo de incubação inerente ao teste de esterilidade ocasionam dificuldades logísticas e espaciais, nas incubadoras. Constituem-se, assim, limitações severas para os produtores, ocasionando pressões intensas das associações representativas sobre os organismos regulatórios, além de potencial risco de desabastecimento a hospitais e clínicas e, consequentemente, aos pacientes.
Tendo em vista os resultados obtidos, pode-se concluir que a tecnologia de bioluminescência de ATP é uma opção considerável para a análise de produtos estéreis, podendo oferecer, resultados mais rápidos que o método convencional. Apesar de não ser uma tecnologia rápida e permanecer dependente de limitações inerentes aos métodos baseados em crescimento, a técnica de bioluminescência de ATP pode ser caracterizada como um grande avanço na microbiologia farmacêutica.
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PICANÇO, Aline Marinho. Estudo
para validação de método rápido microbiológico aplicado a teste de esterilidade:
técnica de bioluminescência de ATP. 2014. Dissertação (Mestrado em Produção e
Controle Farmacêuticos) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de
São Paulo, São Paulo, 2014. doi:10.11606/D.9.2014.tde-26052015-135426. Acesso
em: 2017-10-19.
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